CRISPR基因编辑技术是生物医学领域的关键技术，然而，CRISPR系统可能存在的脱靶效应是制约其临床应用的障碍。虽然领域内已开发了若干CRISPR基因编辑脱靶效应预测的计算模型，但是这些模型尚缺乏对于CRISPR系统分子机制、特别是其动力学机制的深入理解，其全基因组范围内的脱靶预测结果往往差强人意。

近日，3344体育官方入口生物信息学系、3344体育官方入口-上海自主智能无人系统科学中心刘琦教授课题组，联合之江实验室、罗氏上海创新中心和中国农业科学院等团队在Nature Communications上发表了题为Genome-wide CRISPR off-target prediction and optimization using RNA-DNA interaction fingerprints的文章，发布了领域内首个基于分子互作指纹的CRISPR靶向效应预测和sgRNA优化模型CRISOT。针对CRISPR脱靶预测中面临的瓶颈，融合分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟和人工智能（artificial intelligence, AI）技术，利用MD模拟分析和构建CRISPR的RNA-DNA分子互作指纹，结合AI算法开发CRISPR脱靶预测模型，并提出有效的向导RNA（sgRNA）优化方法。GUIDE-seq和WGS实验均证明CRISOT在全基因组脱靶效应预测和sgRNA优化上的高准确率和泛化性能。

本研究开发的CRISOT工具包包含四个模块（图1），即CRISOT-FP、CRISOT-Score、CRISOT-Spec和CRISORT-Opti，分别用于分子互作指纹生成、全基因组CRISPR脱靶预测、sgRNA靶向特异性评估和Cas9系统的sgRNA优化。依托之江智能计算基因平台，CRISOT网站目前已发布于crisot.aigene.org.cn/，方便研究人员使用。

图1. 结合分子机制的Cas9靶向效应预测的计算框架

CRISPR-Cas9介导的DNA剪切的分子机制，是由Cas9-sgRNA-DNA复合体内部的一系列互作驱动的，这些分子互作也决定了其脱靶效应的产生。本研究以Cas9-sgRNA-DNA复合体的核心——sgRNA-DNA为基础（图1a），设计并开展MD模拟表征CRISPR系统的RNA-DNA分子互作特征，包括氢键、结合自由能、原子位置和碱基对的几何特征等（图1b），这些特征构成了sgRNA-DNA的分子互作指纹，即CRISOT的第一个也是首要的模块——CRISOT-FP（图1c）。CRISOT-FP可以作为一种分子指纹（表征）, 以一种灵活的方式与不同的AI模型结合，用于预测CRISPR脱靶效应，本研究开发的模型表现出优秀的脱靶效应预测能力。

在此基础上，本研究将关键互作特征用于开发一个全新的、高效的脱靶效应打分方法，即CRISOT-Score（图1d），用于计算给定脱靶序列的脱靶打分。基于CRISOT-Score，通过叠加sgRNA在全基因组范围内所有CRISOT-Score打分高的脱靶位点，得到衡量该sgRNA靶向特异性的打分，即CRISOT-Spec（图1e）。最后，本研究基于CRISOT-Score和CRISOT-Spec，开发了一种创新性的优化sgRNA的方法，即CRISOT-Opti（图1f）。面向靶向特异性不尽如人意的sgRNA，CRISOT-Opti通过引入单碱基突变获得突变体sgRNA并从中识别能维持一定打靶活性同时靶向特异性大大提升的突变体sgRNA。

本研究通过全面的计算和实验测试表明，CRISOT相较于现有工具的脱靶预测性能获得了很大的提升，且在准确预测BE（base editor）和PE（prime editor）的脱靶效应方面显示出潜力，表明RNA-DNA分子互作指纹捕获了不同CRISPR系统之间RNA-DNA相互作用的潜在机制。本研究所采用的引入MD的方法，本质上是一种结合物理先验的AI方法，可以克服全基因组范围内脱靶预测模型对于大量训练样本的依赖，体现出一种考虑物理先验的小样本和可解释性的AI思想。

基因编辑作为一种疾病干预手段，已逐渐进入临床阶段，近日（2023.11.16），全球首个基于CRISPR-Cas9的基因编辑疗法CASGEVY^TM在英国获得有条件的上市许可，用于治疗镰刀状细胞贫血病（SCD）和输血依赖性 β 地中海贫血（TDT），然而，其潜在脱靶问题及由此带来的健康风险仍将持续受到关注。本研究通过WGS实验表明，CRISOT成功优化了靶向原发性高胆固醇血症关键基因PCSK9和镰刀状细胞贫血病关键基因BCL11A的sgRNA，提高了其靶向特异性，表明CRISOT是全基因组CRISPR脱靶预测、评估和sgRNA优化的一个有效和可推广的系统，可降低CRISPR基因组编辑中的脱靶风险。可以预见，CRISOT将有助于sgRNA设计和优化，推动基因编辑进入临床级别的应用。

该论文通讯作者是3344体育官方入口刘琦教授、原罗氏上海创新中心张清博士和中国农业科学院左二伟研究员，共同第一作者为之江实验室陈钦畅、3344体育官方入口啜国晖和中国农业科学院张海航。获得了罗氏上海创新中心和3344体育官方入口-上海自主智能无人系统科学中心智能学科方向的大力支持。该工作目前依托罗氏和3344体育官方入口，已申请国际PCT专利一项，后续正在开展进一步的临床转化研究。